一抗和二抗不匹配

使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）

没有足够的一抗与目标蛋白结合

提高一抗用量。延长4℃孵育时间（如过夜）

由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效

做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性

样本中没有目标蛋白

建议做阳性对照

目标蛋白含量太少

应用信号放大操作

脱蜡不彻底

延长脱蜡时间，更换二甲苯

固定液封闭了抗体识别表位

缩短固定时间，加强抗原修复

蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜

对样本进行破膜通透处理

PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根

在抗体PBS储存液中加入适量防腐剂，或使用新鲜无菌的PBS

封闭不充分

选择合适的封闭液，延长封闭时间

一抗浓度过高

针对一抗做浓度梯度实验，选择合适浓度

孵育温度过高，时间过长

选择4℃过夜或缩短孵育时间

二抗质量不佳

不加一抗，做二抗对照，选择合格二抗

组织冲洗不彻底

加强洗涤

内源性过氧化物酶含量过高

延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min

固定过度

改变抗原修复方法或减小抗原修复强度。

信号过度放大

缩短抗体孵育时间

通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

去除缓冲液中的通透剂

显色底物过量或显色时间太长

缩短底物孵育时间

一抗/二抗浓度过高

降低抗体浓度和或缩短孵育时间

存在内源性过氧化物酶活性

延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min

一抗与被染组织同源(如用鼠一抗检测鼠组织)，加二抗后，二抗会与同源的所有组织结合

应用与组织非同源的一抗

切片/细胞变干

保持切片/细胞湿度，切勿变干。