【检验原理】

利用抗原抗体特异性结合的原理，在免疫组织化学染色过程中，一抗与组织中抗原特异性结合，形成抗原抗体复合物，酶标二抗与该复合物特异性结合，并通过酶促反应用DAB显色，组织切片中相应抗原位置出现着色。通过显微镜阅片，判速结果。

【样本要求】

1. 适用样本类型:福尔马林固定的石蜡组织切片。

2.包埋及组织切片:组织经石蜡包理后切片, 切片厚度3~5um,粘附在防脱载玻片上，60℃烤片1~2小时。

3.样本的稳定性：为防止抗原丢失，未染色的切片置于室温不宣超过2周，置于2～8℃冰箱不宜概过久。

【检验方法】

1.检测所需仪器、设备和耗材

电热恒温培养箱、光学显微镜、耐高温耐酸碱染色架、高压锅等。

2.试剂配制

抗原修复液、PBS冲洗缓冲液、DAB试剂:配制及使用方法见各自产品说明书。

3.实验步骤

1）脱蜡和水化

将玻片依次浸泡在如下试剂中进行脱蜡和处理，二甲苯Ⅰ，10min →二甲苯Ⅱ，10min →无水乙醇Ⅰ，5min →无水乙醇Ⅱ，5min。→95％乙醇，5min →85%乙醇，5min →75%乙醇，5min →蒸馏水冲洗，1min→TBS 浸洗，5min×3次。

2）抗原修复

高压锅中，加入EDTA （PH9.0）抗原修复液，将切片置于其中，修复液需完全漫过组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火持续加热；待压力开关喷气转动后调至中火，同时开始计时2min，计时结束后离开热源，放气后在室温下冷却20min后将高压锅移入冷水中冷却，待冷却至室温取出切片，TBS冲洗切片2min×3次。

3）封闭

将切片置于3%过氧化氢溶液中，室温封闭10 min。取出切片，TBS中洗缓冲液中浸洗5min×3次，甩干清洗液。

4）滴加一抗

根据检测需要滴加100μL一抗或空自对照试剂，37℃孵育120min或者4℃过夜。TBS冲洗缓液浸洗5min×3次。

5）滴加HRP标记二抗

滴加50 μL，室温孵育30min;TBS缓冲液浸洗5min×3次。

6）DAB显色

滴加DAB显色剂，50μL室温育1-5min，蒸馏水终止显色，流水冲洗2-5min。

7）复染反蓝

将显色完成的组织切片置于苏木素中复染30s-3min。流水冲洗1-2min，返蓝。

注意:需要控制苏木素染色液的染色强度，颜色过浅或过深都会干扰显色结果的观察。

8）脱水透明

①将玻片依次浸泡在如下试剂中进行脱水处理，85％乙醇，2min →95％乙醇，2min →无水乙醇Ⅰ，2min →无水乙醇Ⅱ，4min。

②将组织切片从最后一缸无水乙醇中取出，甩去多余酒精，自然晾干。

③二甲苯透明1-2min。

9）封片

①将已透明处理的切片取出，滴一滴中性树胶至组织切片中央。

②取一块盖玻片，将盖玻片一端放置于切片上，然后缓慢将盖玻片放下，并覆盖所有组织，避免气泡产生。

③将切片放于切片板，通风橱内晾干

10）结果判读

在光学显微镜下对染色后切片进行现察和结果判读。

阳性:目的抗原HRP标记抗体显色为棕黄色。用性:检测组织目标细胞未观察到棕黄色